Diplomarbeiten

Eisentransport in der humanen Plazenta: Untersuchung von Expression und Lokalisation der Kandidatenproteine ZIP8 und Hephaestin-like 1 in der Plazentaschranke

Ausreichender Eisentransport über die humane Plazenta ist für eine gesunde Entwicklung des Föten von großer Bedeutung. Die Plazentaschranke, die beim Nährstofftransport vom mütterlichen zum kindlichen Blut überwunden werden muss, besteht aus 2 Zelltypen, nämlich dem Synzytiotrophoblast (STB), der dem mütterlichen Blut zugewandt ist, und den fötalen Endothelzellen (FEC). Der Eisentransport über die Plazentaschranke ist sehr wenig charakterisiert, involviert aber vermutlich eine große Anzahl unterschiedlicher Proteine wie Transporter, Rezeptoren oder auch Oxidasen und Reduktasen. Eine genaue Charakterisierung des Eisentransportes ist für eine Verbesserung von Eisensupplementationstherapien bei Schwangeren und deren ungeborenen Kindern sehr wichtig. Zwei Kandidatenproteine des plazentaren Eisentransportes sind Zinc-and-iron-related Protein 8 (ZIP8) und Zyklopen/Hephaestin-like 1 (HephL1). ZIP8 ist ein Eisentransporter der zweiwertiges Eisen über Plasmamembranen, aber auch endosomale Membranen transportieren kann. Zyklopen/HephL1 kann Eisen von der zweiwertigen zur dreiwertigen Form oxidieren. Beide Proteine wurden bereits in BeWo-Zellen nachgewiesen. Dies ist eine immortalisierte Choriokarzinom-Zelllinie, die als in vitro Modell zur Untersuchung von Trophoblasten dient. Das Ziel dieser Diplomarbeit war die Untersuchung der Expression und gegebenenfalls der Lokalisation der beiden Proteine in der humanen Plazenta.

Um die Anwesenheit von mRNA nachzuweisen wurde eine qPCR durchgeführt. Dabei werden Molekül-spezifische Primer verwendet, die Fluorochrome gebunden haben. Diese werden bei Amplifikation des gesuchten Moleküls freigesetzt und können dann als ansteigende Fluoreszenz detektiert werden. Referenzgene wurden untersucht, um die Transkription von ZIP8 und HephL1 in BeWo und Plazentaproben vergleichen zu können. Zum Nachweis der Proteinexpression wurden Plazenta- und BeWo-Proteinlysate mithilfe einer SDS-PAGE aufgetrennt. Nach Übertragung aller Proteine auf eine Membran wurde die ZIP8 und HephL1 Expression mit spezifischen primären Antikörpern und enzymkonjugierten sekundären Antikörpern sowie einem chemilumineszenten Substrat untersucht. Das dadurch emittierte Licht wurde mittels eines photosensitiven Films detektiert. Um die Proteine an der Plazentaschranke lokalisieren zu können, wurde Immunfluoreszenzmikroskopie angewandt. Dazu wurden dünne Schnitte von fixiertem Plazentagewebe mit Antikörpern inkubiert, welche mit Fluorochromen konjugiert waren. Die Fluoreszenz wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht und detektiert.

Dieses Projekt beschäftigt sich mit der Entwicklung einer Biolayer-Interferometrie Methode zur Bestimmung der Aktivität von TNF-α-Antagonisten, die zur Behandlung von z.B. Rheumatoider Arthritis eingesetzt werden können.

Dazu standen als Proben drei verschiedene Antagonisten, die von der Firma Sandoz zur Verfügung gestellt worden sind, und das „BLItz“-Gerät der Firma forteBIO zur Verfügung. Mit Hilfe dieses Gerätes ist es theoretisch möglich, über die Bestimmung des Verlaufes der Assoziation und Dissoziation einer Bindung Konstanten zu berechnen, die die Bindungsaktivität beschrieben.

Für die Messungen wurde das Zielprotein TNF-α an Biotin gekoppelt und dieses anschließend an Streptavidin-Sensoren immobilisiert. Nachdem die Antagonisten diversen Stressfaktoren ausgesetzt worden sind, wurde deren Aktivität bestimmt und mit ungestressten Proben verglichen. Zusätzlich wurde zur alternativen Bestimmung der Aktivität eine Methode mit Protein A Sensoren getestet.

Das Ergebnis des Projekts war, dass wahrscheinlich nur chemische Modifikation, wie z.B. Deamidierung bei niedrigem pH-Wert oder Oxidation, die Bindungsaffinität beeinflussen können. Die Messerergebnisse lassen darauf schließen, dass eine physikalische Degradation der Antagonisten, die unweigerlich Aggregation verursachte, zur vollkommenen Inaktivität der Bindungsdomäne führt. Weiteres konnte gezeigt werden, dass durch die starke Affinität zwischen Antagonist und TNF-α eine Bestimmung die kinetischen Parameter im BLItz-System praktisch nicht durchführbar ist. Es kann somit angenommen werden, dass das BLItz-System für den konkret untersuchten Anwendungszweck nicht geeignet ist.

Vergleich von unterschiedlichen Dextranaseproduzenten im Klein- und Großmaßstab

Die grundlegende Idee dieser Arbeit bestand darin, den bestmöglichen Dextranaseproduzenten unter verschiedensten Bedingungen zu finden, welcher zukünftig großtechnisch eingesetzt werden soll. Dazu wurden drei verschiedene Mikroorganismen herangezogen und miteinander verglichen.

Produktion von Dextranase mithilfe verschiedener Mutanten des Pilzes Chaetomium gracile in Schüttelkolbenexperimenten:

Der Pilz Chaetomium gracile wurde im Vorfeld bereits mit UV-Strahlen behandelt. Die dabei generierten Mutanten wurden unter verschiedenen Bedingungen in unterschiedlichen Nährmedien in mehreren Screeningrunden kultiviert. Die Dextranaseproduktion der einzelnen Stämme wurde dem unbehandelten Wildtypen gegenübergestellt.
In allen getesteten Nährmedien konnte Dextranaseaktivität gemessen werden, jedoch zeigte der Zusatz von Glucose beziehungsweise Saccharose eine hemmende Wirkung. Zwischen Wildtyp und Mutanten war kaum ein Unterschied erkennbar, wobei die maximale Aktivität der Dextranase bei einer der Mutanten mit knapp unter 300 U/mL gemessen werden konnte.


Screening der Hefe Lipomyces starkeyii als alternativen Dextranaseproduzenten:

Da nur unzureichende Informationen zur optimalen Kultivierung der Hefe Lipomyces starkeyii für die höchstmögliche Dextranaseproduktion vorliegen, wurde die Hefe in unterschiedlichen Nährmedien angezüchtet und deren Dextranaseproduktivität verglichen. Das Ziel hierbei war es, die Produktivität der Hefe der des filamentösen Pilzes Chaetomium gracile gegenüberzustellen.
Bei den hierbei herangezogenen Nähmedien konnten keine essentiellen Unterschiede gefunden werden, obwohl deren Zusammensetzung in verschiedensten Punkten (Kohlenstoff-, Stickstoffquellen, etc.) variierte.  Da Aktivitätswerte von höchstens 4 U/mL erzielt werden konnten, ist diese Hefe im Gegensatz zum Pilz großtechnisch nicht einsetzbar.

Fermentation von zwei Dextranaseproduzenten im Klein- und Großmaßstab:

In diesem Teil der Arbeit wurden der Pilz Chaetomium gracile und die Hefe Lipomyces starkeyii bezüglich ihrer Produktivität des Enzyms Dextranase miteinander verglichen. Zur Kultivierung wurden Bioreaktoren im drei- beziehungsweise zwanzig Litermaßstab herangezogen, in denen die Messparameter exakt eingestellt und konstant gehalten wurden.
Durch die Fermentationen wird ersichtlich, dass die Hefe ihre exponentielle Phase zwar um ein Vierfaches schneller erreicht als der Pilz, da die gebildete Dextranase jedoch Aktivitätswerte von 3 U/mL nicht überschreitet wird die Dextranaseproduktion durch den Pilz nach der gleichen Kultivierungsdauer mit Werten von 6,3 U/mL bevorzugt.